Қазақша рефераттар

Дегидрогеназаларды анықтау әдістері

Изоферменттерді гельде электрофорез арқылы бөлгеннен кейін оларды гистохимиялық әдістермен айқындайды. Қазіргі кезде изоферменттерді бояудың көптеген тәсілдері қолданылады. Барлық әдістердің ортақ принципі бір: фермент субстратпен әрекеттескенде түзілетін өнім бояғышпен ерімейтін кешен (комплекс) құрайды. Бұл кешен гельде боялған жолақтар ретінде көрініп, изоферменттердің гельдегі орналасуын дәл анықтауға мүмкіндік береді.

Негізгі қағида

Реакция нәтижесінде пайда болған қосылыс пен бояғыштың ерімейтін кешен түзуі гельде айқын жолақтарды береді. Осы жолақтардың орналасуы әртүрлі изоферменттердің белсенді аймақтарын көрсетеді.

Изоферменттерді гистохимиялық бояудың кең таралған әдістері

Төменде тәжірибеде жиі қолданылатын бірнеше тәсіл берілген.

1) Эстераза, негіздік және қышқылдық фосфатазаны анықтау

Субстраттар

  • α-нафтилацетат
  • β-нафтилацетат
  • нафтилпропионат
  • нафтилфосфат

Бояғыштар

  • тетрадиазотталған о-дианизидин
  • гексоазотталған негіздік фуксин
  • диазотталған тұрақты ароматты аминдер

Фермент субстратты катализдегенде бос нафтол бөлінеді. Бояғыштар нафтолмен қоңыр түсті боялған қосылыстар түзеді, соның нәтижесінде фермент орналасқан аймақ гельде қоңыр жолақ ретінде көрінеді.

Ескерту

Эстеразаны бояуда жиі қолданылатын бояғыштар: Fast Blue RR, Fast Blue B және т.б.

2) Каталазаны анықтау

Каталазаны анықтау үшін электрофорезге дейін гель құрамына крахмал қосылады. Бұл изоферменттердің бөлінуіне және полиакриламидтің полимерленуіне кедергі келтірмейді.

Әдістің барысы

  1. Электрофорезден кейін гельді бірнеше минут H2O2 (сутек асқын тотығы) ерітіндісінде ұстайды.
  2. Содан соң гельге KI ерітіндісін қосады.
  3. H2O2 пен KI әрекеттесіп, бос I2 бөлінеді.
  4. Бөлінген I2 крахмалды көк түске бояйды.

Каталаза белсенді аймақтарында ақ түсті айқын жолақтар пайда болады (көк фонда түссіздену ретінде байқалады).

3) Дегидрогеназаларды анықтау

Дегидрогеназалардың гистохимиялық боялуы әдетте бірнеше сатыда жүреді. НАД- және НАДФ-спецификалық дегидрогеназалар үшін (мысалы, алкогольдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа) инкубациялық орта құрамының негізгі компоненттері ұқсас болады; айырмашылық көбіне тек субстрат түріне байланысты.

Субстрат мысалдары

  • органикалық қышқылдар және олардың тұздары
  • алма қышқылы
  • сірке қышқылы және т.б.
  • спирттер

Бояғыш

Нитрокөк тетразолий қолданылады. Ол тотықсызданған НАД(Ф)-пен әрекеттесіп, күлгін (фиолетті) түсті қосылыс түзеді.

Қорытынды және әдеби деректер

Әдебиеттерде 60-тан астам ферментті бояуға арналған 90-ға жуық әдіс сипатталған. Тәжірибеде нақты фермент түріне, субстратқа және визуализация талаптарына сәйкес әдіс таңдалып, гельдегі изоферменттердің орналасуы жолақтар арқылы бағаланады.