Қазақша рефераттар

Экспериментке жануарды таңдау

Гибридомалық технология: мақсаты және мәні

Гибридомалық технологияның негізгі міндеті — гибридомаларды, яғни гибридті жасуша клондарын алу. Бұл клондар иммунделген BALB/c тышқандарының В-лимфоциттері мен миелома (ісіктік) жасушаларын будандастыру (гибридизация) арқылы түзіледі.

Алынған гибридті жасушалар екі маңызды қасиетті біріктіреді: бір жағынан олар телімді (спецификалық) антиденелерді синтездейді, екінші жағынан — жасанды қоректік ортада шексіз көбею қабілетіне ие.

Негізгі нәтиже: гибридомалық технология арқылы бір жасушадан тараған жасушалар түзетін моноклоналды антиденелерді үздіксіз алуға болады.

Моноклоналды антиденелердің ерекшелігі

Моноклоналды антиденелер (МКА) иммундеу кезінде қолданылған антигеннің тек бір ғана детерминантасына бағытталады. Сондықтан олардың телімділігі өте жоғары болады.

Поликлоналды антиденелер

Вирустарға қарсы түзілетін иммуноглобулиндер жиі поликлоналды және гетерогенді болады, өйткені олар әртүрлі В-лимфоцит клондарынан шыққан антиденелер қоспасы.

Моноклоналды антиденелер

Антиген молекуласындағы белсенді топтардың (бірнеше аминқышқыл қалдықтарының) нақты кешеніне қарсы бір ғана моноспецификалық антидене синтезделеді. Мұндай антиденені бір клон өндіреді.

Түрлік шектеулер және қазіргі бағыттар

Бұрын гибридтеу үшін көбіне тышқан немесе егеуқұйрық миеломалық жасушалары мен В-лимфоциттері қолданылды. Алайда мұндай антиденелер кей жағдайда емдеуде шектеулі, өйткені олар адам ағзасы үшін генетикалық бөгде болып саналады.

Қазіргі күні адам гибридомаларын қолдану арқылы моноклоналды антиденелер алу мүмкіндігі бар, бірақ мұндай гибридомаларды алу қиын, себебі:

  • адам гибридомалары баяу өседі;
  • тұрақсыздығы жоғары болуы мүмкін.

Адам иммундық жасушаларына негізделген гибридомалардың маңызды артықшылығы — тышқан мен егеуқұйрық МКА-лары байқамайтын антигеннің өте ұсақ өзгерістерін анықтай алуы.

В-лимфоциттер қатысатын химералық гибридомалар да алынған, бірақ қазіргі кезде олар сирек қолданылады.

Антиденелер және антигендер: қысқаша анықтамалар

Антиденелер (иммуноглобулиндер) — жоғары арнайыланған ақуыздар. Олар бөтен антиген ағзаға енгенде В-лимфоциттермен өндіріледі және сол антигенмен таңдамалы түрде байланысуға қабілетті.

Антигендер ретінде инфекция қоздырғыштары (бактериялар, вирустар, қарапайымдылар) ғана емес, сондай-ақ инфекциялық емес биоорганикалық заттар да болуы мүмкін.

Технологияның қалыптасу тарихынан

Моноклоналды антиденелер технологиясындағы шешуші кезең — гибридома алу әдісінің дамуы. Молекулалық биолог Мильстайн егеуқұйрық пен тышқан миеломалық жасушаларын біріктіру бойынша тәжірибелер жүргізді. Оның ғылыми әріптесі Кёлер иммундық жауаптағы антиденелердің вариабельдігін және иммуноглобулин синтезін кодтайтын гендердегі мутация үдерістерін зерттеді.

Кёлер миеломалық жасушаларды біріктіру техникасын меңгеріп, белгілі антигенге қарсы антидене секрециялайтын жасуша клондарын алу идеясын дамытты: миеломалық жасушаны бұрын нақты антигенмен байланысқан популяциядан алынған В-лимфоциттер клонымен біріктіру.

Моноклоналды антиденелерді алу кезеңдері

  1. 1. жануарларды иммундеу;
  2. 2. иммунделген тышқандардың В-лимфоциттері мен миелома жасушаларын будандастыру;
  3. 3. МКА синтездейтін гибридомаларды анықтау (скрининг);
  4. 4. МКА-ны тұрақты синтездейтін гибридомаларды клондау;
  5. 5. алынған МКА-ға сипаттама беру;
  6. 6. гибридомаларды in vivo және in vitro өсіріп, МКА-ны көп мөлшерде жинау;
  7. 7. моноклоналды антиденелерді тазарту;
  8. 8. гибридті жасушаларды сақтау (криоконсервация).

Әдістің ұстанымы

Әдістің негізінде сенсибилизацияланған көкбауыр лимфоциттері мен миеломалық жасушаларды қосқаннан кейін гибридті жасушаларды сериялық өсіру жатады. Кейін қажетті ерекшелігі бар антиденелерді секреттейтін клондар іріктеледі. Іріктелген клон жасуша дақылы ретінде сақталады немесе тышқан ағзасында асциттік ісік түрінде жүргізіледі.

ГАТ-селекция: гибридомаларды қалай іріктейді

Гибридомаларды қосылған жасушалардан бөліп алу үшін қоректік ортаға гипоксантин, аминоптерин және тимидиннен тұратын ГАТ ортасы енгізіледі.

Неге миелома жасушалары өледі?

Көптеген миелома желілері ГГФРТ (гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза) ферментін синтездеу қабілетінен айырылған. Сондықтан гипоксантин алмасуы бұзылып, жасуша улануға ұшырайды да, тіршілік қабілетін жоғалтады.

Неге гибридомалар қалады?

Гибридомалар В-лимфоциттен ГГФРТ-тің функционалды көшірмесін алады, сондықтан ГАТ ортасында тірі қалады. Ал таза В-лимфоциттер белгілі уақыттан кейін өздігінен өледі, себебі олар дақылда шексіз көбейе алмайды.

Әдетте 10–14 күн ішінде әр гибридомадан клон (бір жасушадан тараған ұрпақтар жиынтығы) қалыптасады. Гибридомалар арасынан антигенге ең жоғары үйлесімділігі бар антиденелер түзетін клондар иммунологиялық әдістермен (мысалы, ИФТ, ИФР, агглютинация реакциялары және т.б.) анықталады.

Клон біртекті жасушалардан тұратындықтан және біртекті антидене синтездейтіндіктен, гибридома өндіретін иммуноглобулиндер моноклоналды антиденелер деп аталады. Гибридома үздіксіз көбейетіндіктен, мұндай антиденелерді шексіз көлемде алуға болады.

МКА өндірудің практикалық жолдары

МКА-ны көп мөлшерде алу үшін гибридоманы сингенді тышқандардың құрсақ қуысына енгізіп, асцит арқылы өсіруге болады. Бір тышқанның асцит сұйықтығынан шамамен 40–50 мг дейін МКА алу мүмкін.

Әдістің дамуына әсер еткен алғышарттар

  • миелома жасушаларын алу және оларды ағзадан тыс өсіру;
  • жасушалардың соматикалық гибридизация әдісін меңгеру.

Зертханалық үдеріс (жалпы схема)

Иммунизация үшін алдын ала тазартылған антиген қолданылады. Антиген әдетте 3–5 рет, 0,5–5 мг мөлшерде енгізіледі; алғашқы инъекция жиі Фрейнд адъювантымен бірге жасалады. Соңғы иммунизациядан 2–4 күн өткен соң тышқандардан көкбауыр алынып, жасуша суспензиясы дайындалады; центрифугалау арқылы жасушалар жиналады, ал тіршілікке қабілеттілігі трипан көгі ерітіндісімен бояу арқылы бағаланады.

Жасушаларды қосу (гибридизация) логикасы

Көкбауыр жасушалары миеломалық жасушалармен белгілі қатынаста араластырылып, қосылуды ынталандыру үшін ПЭГ (полиэтиленгликоль) қолданылады. Одан кейін жасушалар ГАТ ортасына ауыстырылып, бірнеше күн сайын қоректік орта жаңартылып отырады. Бірнеше апта ішінде тірі қалған клондар бөлініп алынып, ұсақ ұяшықты планшеттерге көшіріледі.

Скрининг және реклондау

Дақыл сұйықтығы жүйелі түрде иммунологиялық әдістермен тексеріліп, тышқан иммуноглобулиндерінің болуы және қажетті спецификалық антидене секрециясы анықталады. Перспективалы клондар қайтадан микродақылдарда реклондап, тұрақты продуцент линиялар ретінде бекітіледі.

Дақыл сұйықтығында моноклоналды антиденелер болған жағдайда, оларды эксперименттерде, иммунодиагностикумдар дайындауда және әртүрлі биотехнологиялық үдерістерде қолдануға болады.

Жұмысты ұйымдастыру және құрал-жабдықтар

Гибридомаларды алу жұмыстары әдетте бөлек бөлмеде жүргізіледі. Қажетті негізгі құрал-жабдықтар:

  • ламинарлы бокс;
  • температура, ылғал және CO2 режимі бақыланатын инкубатор;
  • центрифуга;
  • микроскоптар.
  • тоңазытқыштар (+4 °C) және төмен температуралы мұздатқыштар;
  • су моншасы (+37 °C және жоғары температуралық режимдер);
  • криосақтауға арналған мұздатқыш (мысалы, -70 °C) және сұйық азотқа арналған Дьюар ыдысы.

Тұтыну материалдары

Жасуша дақылдары үшін арнайы пластик ыдыстар алдын ала дайындалады: түбі тегіс 96-ұялы және 24-ұялы планшеттер, 25 және 75 см2 культуралық флакондар, культивирлеу ортасы және қажетті реактивтер.

Экспериментке жануар таңдау

Иммунизация үшін көбіне тышқандар және егеуқұйрықтар қолданылады, өйткені бұл жануарларда миеломалық жасушалар жақсы өседі. Басқа жануар түрлері әдетте қолданылмайды.

Бүгінгі күні гибридомаларды алу және оларды тұрақтандыру — биотехнологиядағы ең өзекті бағыттардың бірі. Бұл технология жоғары телімді моноклоналды антиденелерді өндіру арқылы диагностика, зерттеу және терапия салаларына тікелей әсер етеді.