Тышқандар топтарын иммунизациялау үшін қолданылған антиген түрлері
Моноклоналды антиденелердің (МКА) ғылымдағы және диагностикадағы маңызы
Моноклоналды антиденелер (МКА) биологияда, ветеринарияда және медицинада аса сезімтал талдау жүргізуге баға жетпес көмек береді. Қазіргі кезде МКА қолдану арқылы адам мен жануарлар үшін қауіпті жұқпалы ауруларды анықтайтын тиімді әрі жоғары сезімтал диагностикалық тәсілдер әзірленіп, практикаға енгізілуде. Мұндай ауруларға бруцеллез, туберкулез, құс тұмауы, африкалық шошқа обасы және басқалары жатады.
Бруцеллез: антигендер, МКА және диагностиканы жетілдіру
Иммуногенді антигендер және гибридома штамдары
Зерттеулер бруцеллез қоздырғышының Поли-В антигені мен сыртқы мембрана белоктарының иммуногендік қасиеті тұтас жасушаларға қарағанда жоғары екенін көрсетті. Осы антигендерді пайдалану арқылы бруцеллалардың полисахаридтері мен басқа да антигендеріне қарсы МКА түзетін бірнеше гибридома штамдары алынды.
Алынған антиденелер көмегімен липополисахаридтер мен Поли-В антигенінің белгілі бір бөлігінде Brucella және Yersinia enterocolitica O9 бактерияларына ортақ мульти-/унивалентті детерминанттардың бар екені анықталды.
Сыртқы мембрана белоктары
Электрофорез және МКА көмегімен бруцеллалардың сыртқы мембранасында молекулалық массалары 48, 43, 25 және 14 кДа болатын белоктардың бар екені көрсетілді. Бұл белоктардың агглютиногендік қасиеті байқалмады: оларға қарсы дайындалған қан сарысуы агглютинация реакциясында бруцелла жасушаларын желімдей алмады.
Балау (диагностика) үшін практикалық тиімділік
Алынған гибридома штамдарының МКА-лары бруцеллезді балау әдістерін жетілдіруде қолданылды. Мысалы, енжар гемагглютинация реакциясында МКА-мен сенсибилизацияланған эритроциттер бруцеллаларды идентификациялауда поливалентті қан сарысуынан дайындалған диагностикумдарға қарағанда тиімдірек болды.
БАМА және БИМА штамдары: жылдам анықтау тәсілдері
БАМА және БИМА деп белгіленген штамдардың МКА-лары бруцеллезбен ауырған жануарлардан алынған материалдарда қоздырғыш антигендерін жедел анықтауға мүмкіндік беретін әдістерде қолданылады: иммунды-ферменттік талдау (ИФТ), латекс-агглютинация және енжар агглютинация.
Практикаға ұсынылған жиынтық
Бруцеллезді МКА көмегімен ИФТ арқылы анықтауға арналған реактивтер жиынтығы (ТУ 10.05.4000.326-92)
Нәтиже уақыты
3–3,5 сағат
Материал
Патологиялық материал: паренхиматозды ағзалар, сөл бездері, іш тасталған төлдердің ағзалары.
Сезімталдық
0,0015–0,003 мкг/мл
Салыстыру
Қоздырғышты бөліп алу лабораторияда орта есеппен 15–30 күн алады.
Диагностикумда ИФТ-ның қатты фазасы ретінде нитроцеллюлозды қағаз қолданылады. Жиынтықтың компоненттері 12 флаконға жинақталған, және жоғары сезімталдығына қарамастан көптеген лабораториялық жағдайда қолдануға ыңғайлы. Диагностикум бұрынғы КСРО халық шаруашылығы жетістіктері көрмесінің күміс медаліне ие болып, республика ветеринарлық лабораторияларында сынақтан өткен.
1C3 және F710: «сэндвич» ИФТ қойылымындағы нәтижелер
1C3 және F710 гибридома штамдарының МКА-лары ИФТ-ның «сэндвич» форматында 3–5 айлық бұзаулар мен қозылардың қан сарысуын бруцеллезге тексеруде сыналды. Бірінші штамм антиденелері бруцеллалардың 14 кДа сыртқы мембрана белогына, ал екіншісі Поли-В антигенінің детерминантасына бағытталған.
Бұл тәсіл практикада кең қолданылатын агглютинация реакциясы (АР), комплемент байланыстыру реакциясы (КБР) және Роз-Бенгал сынамасымен салыстырғанда жоғары сезімталдық көрсетті. Антиген ретінде бруцелла жасушаларының ультрадыбыстық дезинтеграты қолданылды.
Маңызды байқаулар: уызға дейінгі антиденелер және құрсақішілік жұқпа
Бруцеллезбен қолайсыз табындар мен отарларда кейбір төлдердің (5,9–7,4%) уызбен қоректенер алдындағы сарысуында қоздырғышқа сәйкес антиденелер анықталды.
Кейбір төлдерде бруцелла антигендерінің бар екені МКА қолданылған ИФТ арқылы дәлелденді.
Назар аударарлық жайт: табиғи антиденелер бруцеллезден қолайсыз да, сау да табындардағы уыз ішпеген жаңа туған бұзаулар мен қозылардың (9–25%) сарысуында кездесуі мүмкін. Мұндай антиденелер әсіресе АР-дың микронұсқаларымен және ИФТ көмегімен жақсы анықталады.
Осы деректер негізінде құрсақ ішінде бруцеллезбен зақымданған төлдерді анықтау тәсілі практикаға ұсынылып, авторлық куәлік алынған.
Штамдарды сақтау және МКА-ның экономикалық артықшылықтары
Алынған гибридома штамдары (БАМА, БИМА, 1C3) Санкт-Петербургтегі омыртқалы жануарлар жасушаларының арнайы коллекциясына сақтауға тапсырылды. Бұл гибридомалар бруцеллаларға жоғары телімді антиденелердің арзан әрі тиімді көзі бола алады: олар өндіретін МКА-ның белсенділігі мен ерекшелігі коммерциялық поликлоналды қан сарысуымен салыстырғанда жоғары.
МКА-ның жаңа бағыты: ісікке бағытталған дәрі жеткізу
Соңғы жылдары моноклоналды антиденелер ісік жасушаларына арнайы уытты немесе емдік заттарды жеткізу үшін пайдаланыла бастады. Бұл үшін ісікке қарсы МКА-ның вариабельді бөлігі липосоманың сыртқы бетіне берік бекітіледі.
Неліктен липосома «жасырын» тасымалдаушы бола алады?
Организмге енгізілген мұндай препаратқа иммундық жүйе айқын шабуыл жасай бермейді, өйткені липосома мембранасы фосфолипидтерден тұрады және көптеген жасушалардың мембранасына ұқсас. Соның арқасында липосома ішіндегі емдік заттар бұзылмай сақталады.
Нысанаға дәл байланысу және жасушаға ену
МКА-ның вариабельді бөлігі липосоманы белгілі бір ағзаның ісік жасушаларымен байланыстырады. Байланысқаннан кейін липосома жасуша мембранасымен әрекеттесіп, емдік заттардың жасуша ішіне өтуін қамтамасыз етеді.
Қазіргі қолданылатын көптеген МКА тышқан гибридомаларынан алынады. Алайда тышқан антиденелері басқа организм үшін антиген болуы мүмкін. Сондықтан соңғы жылдары адам мен үй жануарлары лимфоциттері негізіндегі гибридомаларды алу бағыты дамып келеді.
Негізгі қасиет: аффинитет
Моноклоналды антиденелердің басты артықшылықтарының бірі — олардың антигенмен байланысу беріктігі, яғни аффинитеті.
Антиидиотиптік МКА: 2D9 және 2G9 штамдары
Гибридомдық технология арқылы бруцеллез антигеніне телімді иммуноглобулин идиотиптеріне бағытталған антиидиотиптік моноклоналды антиденелер алынғаны анықталды: 2D9 штамы IgM класына, ал 2G9 штамы IgG класына (соның ішінде IgG2b тармағына) жатады.
2D9 және 2G9 өндіретін антиидиотиптік МКА өз иммунохимиялық қасиеттері бойынша талаптарға сай және бруцеллез антигенінің «ішкі бейнесі» бола алатындықтан, оларды биологиялық қауіпсіз диагностикалық және профилактикалық препараттар әзірлеуде қолдануға болады.
Титрлеу
Сенсибилизацияланған планшетте асцит сұйықтығынан тазартылған антиидиотиптік МКА 0,005 мг/мл-ден бастап титрленді; реакция нәтижесі бойынша 50% байланысуға сәйкес концентрация анықталды.
Байланысу константасы
Антидене мен детерминанта белсенді орталықтарының сәйкестігі 1×10-7 M шамасымен сипатталды.
Талдаулар
ИФТ (жанама), 7% және 10% ПААГ-электрофорез, 1% агароза геліндегі диффузиялық преципитация қолданылды; аффинитет J. Beatty әдісімен бағаланды.
Зертханада қолданылған негізгі реагенттер мен тәсілдер
- Поли-В және бруцеллездің стандартты антигендері.
- Бруцеллезге монотелімді қоянның antiabortus және antimelitensis қан сарысулары, сондай-ақ телімді поликлоналды сарысу.
- Хроматографиялық талдау: G-100 сефадексі, 0,1 М Tris-HCl (pH 8,0) + 0,2 М NaCl.
- Биотинделген Fab фрагменттерін қолдана отырып, ИФТ-ның жанама әдісімен белсенділікті бағалау.
Электрофорез үлгілерін түсіндіруге арналған белгілер
Mycobacterium tuberculosis бойынша иммундеу және гибридома алу нәтижелері
Иммунизация нәтижелері: антидене титрі
Тышқандар топтарын иммунизациялау үшін Mycobacterium tuberculosis-тің ультрадыбыстық дезинтеграты (УДД) және липополисахаридті антигені (ЛПС) қолданылды. Кесте деректері бойынша, УДД-мен иммунизацияланған тышқандар қан сарысуындағы спецификалық антиденелер титрі ИФТ-да 1:25600-ге дейін жетті. ЛПС антигенімен иммунизациялау кезінде антиденелер ізделіп отырған антигендермен байланысып, 1:12800 титрін көрсетті.
Қолданылған антигендерге қарсы түзілген антиденелер арасында әлсіз қиылысқан байланыстар байқалды, бұл препарат детерминанттарының арасында елеулі айырмашылық бар екенін көрсетеді.
Телімді антиденелер титрі (ИФТ)
| Топ | Иммунизация антигені | M. tuberculosis УДД-на титр | M. tuberculosis ЛПС-на титр |
|---|---|---|---|
| I | M. tuberculosis УДД | 1:25600 | 1:100 |
| II | M. tuberculosis ЛПС | 1:1600 | 1:12800 |
Гибридома алу: жасуша бірігуі және өсудің көрсеткіштері
Зерттеу нәтижелері BALB/c тегіндегі тышқандарды M. tuberculosis-тің УДД және ЛПС антигендерімен иммунизациялау тәжірибелік жануарларда жеткілікті антидене түзілуіне және иммундық жауаптың күшеюіне толықтай жеткілікті болғанын көрсетті. Бұл — спецификалық антидене түзетін В-лимфоцит клондарын белсенді индукциялау белгісі.
Әр топтан антидене титрі ең жоғары жануарлар таңдалып, олардың көкбауыры иммунды лимфоциттердің көзі ретінде пайдаланылды. Лимфоциттер X63-Ag 8.6.5.3 миелома жасушаларымен ПЭГ-4000 қатысуымен гибридизацияланды. Жасушалар біріккеннен кейін гибридома клондары өскен ұяшықтардың үлесі 48,7–61,5% аралығында болды.
Гибридомаларды антидене өнімділігіне тестілеу ортада аздап сарғаю байқалғанда басталды, бұл кезде гибридома жасушалары ұяшық беткейінің шамамен 30%-ын қамтыды. Ең жақсы нәтиже УДД-мен иммунизацияланған тышқандардың спленоциттерін миелома жасушаларымен гибридизациялау кезінде байқалды: 384 ұяшықтың 90-ында өсу болды (23,4%). ЛПС-пен күшейтілген жануарлар лимфоциттерін қолданғанда бұл көрсеткіш 15,6% болды.