Зерттеушілердің мақсаты - өзгешелігі жоғары антиденелерді алу әдістерін табу
Моноклоналды антиденелердің пайда болуы және гибридома технологиясы
Біркелкі және жоғары ұқсастықтағы антиденелерді алу мәселесі 1975 жылы мюнхендік Г. Кёлер мен аргентиналық Ц. Мильштейннің ашқан жаңалықтарының нәтижесінде шешімін тапты. Олардың зерттеулері иммунологияда гибридома және моноклоналды антиденелер дәуірін ашты.
Ғалымдар иммунделген жануарлардың антидене түзетін жасушаларын миелома (ісіктік) жасушаларымен будандастыру арқылы жаңа гибридті жасушаларды — гибридомаларды — алу тәсілін ұсынды. Бұл технология біркелкі антиденелерді синтездейтін гибридомалардың жеке клондарын бөліп алуға мүмкіндік берді.
Гибридома деген не?
- Гибридома — екі түрлі жасушадан алынған гибридті жасуша.
- Бірі — плазмоцитома (жалпы түрде миелома), екіншісі — антидене түзетін В-лимфоцит.
- Нәтижесінде гибридома бастапқы жасушалардың қасиеттерін біріктіреді: В-лимфоцит сияқты белгілі бір антигеннің эпитопына қарсы антидене түзеді және миелома тәрізді өлмейтін (шексіз көбейетін) жасушаға айналады.
Микобактериялар және моноклоналды антиденелер: негізгі деректер
1985 жылы J. Morris микобактериялардан моноклоналды антиденелер (МКА) алудың мүмкіндігін сипаттады. Автор ультрадыбыстық дезинтегратта (УЗД) ақуызбен байланысатын компоненттерді анықтап, вирулентті туберкулез микобактериялары мен олардың бірқатар түрлерін (соның ішінде M. bovis BCG, M. tuberculosis, M. paratuberculosis) ажыратуға болатынын көрсетті.
SB сериясы (P. Wood, 1988)
P. Wood және әріптестері ИФТ (иммуноферменттік талдау) көмегімен культуралды сүзінділерді қолданып, M. bovis және M. bovis BCG штамдарын идентификациялады.
Антиденелер термостабильді ақуыздағы кемінде үш түрлі эпитопты таныды; молекулалық массасы шамамен 22 кДа. Авторлар бұл ақуыз кең зерттелген MPB70 болуы мүмкін екенін атап өтті.
Шектеуі: SB сериясы жоғары спецификалық нәтиже бермеді — оң реакция M. bovis-пен қатар M. tuberculosis-те де байқалды.
M. tuberculosis антигендерінің панелі
Зертханалық жағдайда МКА көмегімен M. tuberculosis антигендерінің бірқатар ақуыздары анықталды (Engers H.D. және т.б., 1986): молекулалық массалары 89, 71, 65, 38, 35, 32, 30, 28, 23, 19, 17, 14 және 12 кДа.
Көптеген МКА осы антигендерді туберкулездің серодиагностикасында қолдануға жол ашты (Van Vooren J.P. және т.б., 1991).
Сонымен қатар моноклоналды антиденелер микобактериялардың геномдық ДНҚ-сына қатысты биотехнологиялық зерттеулерде де пайдаланылды (Vuong R.A. және т.б., 1985).
Моноклоналды антиденелерді алу тәжірибелері: әдістемелік мысал
В. Г. Авиденко және әріптестері (1996) M. tuberculosis антигеніне қарсы моноклоналды антиденелерді алу тәсілін сипаттады. Иммундау үшін BALB/c тышқандары пайдаланылып, M. tuberculosis H37Rv ультрадыбыстық дезинтеграты толық емес Фрейнд адъювантымен бірге қолданылды.
Селекция және нәтижелер
- ГАТ/ГТ (HAT/HT) орталарында стандартты селекция жүргізіліп, лимиттеуші сұйылту әдісімен моноклондар таңдалды.
- Антидене түзілуі M. tuberculosis антигеніне байланысты бақылаумен тексерілді.
- Нәтижесінде 10 гибридома алынып, антиденелер өсінді сұйықтығының супернатантынан және асциттен жиналды.
Әкібеков Ө. С. 2B3C11 штаммынан алынған моноклоналды антиденелердің белсенділігі мен спецификалығын Mycobacterium туыстастығына жататын бактериялардың әртүрлі антигендерімен өзара әрекеттесу арқылы, ИФТ әдісімен бағалады.
Қатысты зерттеулер: Brucella антигендері және МКА
Г. С. Уилсон және А. А. Майлс (1932) агглютининдерді адсорбциялау әдісін қолдана отырып, бруцеллездегі антигендердің екі түрін сипаттады: A-антиген (Brucella abortus) және M-антиген (Brucella melitensis). Олардың қорытындысы бойынша A және M антигендері табиғаты жағынан қатты айырмашылыққа ие емес, бірақ B. abortus штамдарында A-антиген көбірек, ал M-антиген азырақ; B. melitensis-те керісінше.
Андросов М. В. және т.б. (1988) M. bovis-ке спецификалық МКА алынғанын және тиімді иммуноферменттік тест-жүйе әзірленгенін хабарлады. Иммундау үшін 3 апталық BALB/c тышқандары және гамма-сәулемен инактивацияланған M. bovis өсіндісі қолданылды.
Н. С. Куликовская және т.б. (1990) МКА алу және қолдану мүмкіндіктерін M. smegmatis және M. kansasii сияқты микобактерия түрлерін анықтауға бағыттап сипаттады.
Неге моноклоналды антиденелер қажет болды?
Қан сарысуын (поликлоналды антиденелерді) алу технологиясы белгілі бір антигендермен малдарды гипериммундауды және пайда болған антиденелерді бөліп алуды қамтиды. Бұл тәсіл жануарларды күтуге арналған инфрақұрылымды, азықты және арнайы жағдайларды талап етеді.
Поликлоналды жауаптың негізгі шектеулері
- Әр жануардың жеке ерекшелігі иммундық жауаптың құрамын өзгертеді.
- Иммундауда қолданылатын материалдың поливаленттілігі нәтижені күрделендіреді.
- Иммундық жүйенің әртүрлі клондық жасушалары бір антигенге ұқсас болғанымен, толық біркелкі емес антиденелер түзеді.
Соматикалық жасушалар жасанды қоректік ортада ұзақ өсіп-өне алмайды, ал миелома жасушалары шексіз көбейеді. Гибридома технологиясының түпкі идеясы — шексіз көбею қабілетін нақты спецификалық антидене түзу қабілетімен біріктіру.
Иммуноглобулин және зерттеудегі «әмбебап реагент» идеясы
Биологиялық құрылымдарды зерттегенде, сол құрылыммен таңдаулы әрі нақты байланысқа түсетін реагенттерді табу — зерттеудің өзегі. Мұндай қасиет иммуноглобулин молекуласында бар: иммуноглобулиндер антидене ретінде антигендермен арнайы байланысады.
Көптеген құрылымдар белгілі жағдайларда антигенге айналып, комплементарлы антиденелердің түзілуіне себеп болады (мысалы, күшті иммуногендермен конъюгацияланған кезде). Осыған байланысты биология мен медицинаның әртүрлі салаларында антиденелерге негізделген иммунологиялық әдістер кең таралды.
Зерттеушілердің негізгі мақсаты
Жоғары өзгешелігі (спецификалығы) бар антиденелерді алудың сенімді әдістерін табу. Кейбір жағдайларда бактериалды полисахаридтермен иммундау жоғары гомогенді антиденелер пулын береді, алайда ең тұрақты шешім — плазмоцитома жасушаларын иммунделген жануардың көкбауыр жасушаларымен қосып, гибридома алу.
Гибридомалар ісіктік жасушалардан шексіз көбею мүмкіндігін, ал көкбауырдың В-жасушаларынан белгілі спецификалығы бар антиденелерді синтездеу қабілетін алады.
Тарихи толықтырулар: гибридома әдісінің кеңеюі
1975 жылы Цезарь Мильштейн Кембридждегі Медициналық зерттеулер кеңесінің молекулалық биология зертханасында арнайы антигенмен иммунделген тышқанның көкбауырынан алынған В-лимфоциттерді миеломды жасушалармен қосу мүмкіндігін көрсетті. Нәтижесінде ата-ана жасушаларының қасиеттерін біріктіретін, шексіз өсетін және белгілі бір антиденені тұрақты бөлетін гибридті жасушалар алынды. Бұл жаңалық эксперименттік иммунологияда жаңа кезеңді бастады.
1980 жылы М. Карло және басқа зерттеушілер миеломамен ауырған адамның В-лимфоциттерін панэнцефалитпен ауырған адамның перифериялық лимфоциттерімен қосу арқылы адамның түраралық тұрақты антигендерін түзетін гибридома алғаны туралы хабарлады.