Пероксидаза ферментінің белсенділігін анықтау

Қазақстан Республикасы жоғары сапалы бидай өндіруі бойынша әлемдегі ірі елдердің бірі. Ел экономикасы үшін ауыл шаруашылығы стратегиялық мәнге ие, ал оның негізгі бағыты — өсімдік шаруашылығы. Солтүстік Қазақстанда бидай 11,04 млн гектар алқапқа егіледі, бұл егіс көлемінің шамамен 62%-ын құрайды.

Қазіргі таңда жасушалық селекцияда биотехнологиялық әдістер селекциялық жұмыстармен қатар қолданылып, өсімдік иммунитетін индукциялау мақсатында әртүрлі қоздырғыштарға және стресс факторларға жауап беретін селективті жағдайлар кеңінен пайдаланылады. Мұндай тәсіл бағалы бастапқы формаларды іріктеуге, селективті факторлар арқылы төзімді каллус линияларын алуға және сол линиялардан ауру қоздырғыштарына төзімді өсімдіктерді регенерациялауға мүмкіндік береді.

Зерттеудің мақсаты

Селективті ортада бидай сортының каллус ұлпасын өсіріп, ондағы пероксидаза ферментінің белсенділігін зерттеу.

Зерттеу міндеттері

Жасушалық селекция үшін алғашқы каллус ұлпасын алу.
Пероксидаза ферментінің белсенділігін анықтау.

Зерттеу объектісі және бастапқы материал

Зерттеу объектісі ретінде бидайдың Ақмола 2 сорты қолданылды. Бастапқы материал Қазақстан Республикасының Ұлттық биотехнология орталығының өсімдіктер селекциясы мен биотехнологиясы зертханасынан алынған жаздық жұмсақ бидай тұқымдары болды.

Әдістеме: каллус ұлпасын алу

Эксплант және стерильдеу

1 Эксплант ретінде жетілген ұрық тұқымдары алынды.
2 Тұқымдар сабынды сумен жуылып, 10 минут бойы 70% хлораминмен өңделді.
3 Автоклавталған суда ламинар-бокста 1 тәулік ұсталды.
4 Келесі күні асептикалық жағдайда қайта өңделіп, 3 рет автоклавталған сумен шайылды.
5 Агарланған қоректік ортасы бар Петри табақшаларына отырғызылып, 26°C температурада, қараңғыда культивирленді.

Қоректік орталар (NaCl бойынша селекция)

Каллустың түзілуі үшін 4 нұсқа қолданылды (әр орта 0,5 л көлемінде дайындалды):

1) Бақылау

Мурасиге және Скуг (МС)

2) Селективті

МС + 0,3% NaCl

3) Селективті

МС + 0,75% NaCl

4) Селективті

МС + 1% NaCl

Бір сатылы жасушалық селекция кезінде натрий хлориді МС ортасына келесі мөлшерлерде қосылды: 0,3% үшін — 1,5 г; 0,75% үшін — 3,75 г; 1% үшін — 5 г.

Бақылау МС ортасының құрамы (қысқаша)

Минералдық ортаға макротұздар (25 мл), микротұздар (0,5 мл), Fe-хелат (2,5 мл), тиамин-HCl (0,5 мл), мезоинозит (50 мг), 2,4-D (1,5 мл), сахароза (15 г), CaCl₂ (0,220 мг), агар (3,5 г) қосылып, ортаның pH мәні 5,8-ге дейін реттелді.

Орта автоклавта 0,8 атм қысымда 30 минут стерильденді.

Пероксидаза: биологиялық маңызы және принципі

Өсімдік жасушаларында биохимиялық реакцияларды іске асыратын көптеген ферменттер болады. Солардың бірі — пероксидаза. Ол тірі организмдерде кең таралған және өсімдік тіршілігіндегі өсіп-даму, морфогенез, стресс факторларынан қорғану сияқты үрдістерге қатысады. Қорғаныш қызметіне байланысты пероксидазаның белсенділігі фитопатогендермен зақымданған өсімдіктерде жиі жоғары болады.

Катализдейтін реакция

Пероксидаза оксиредуктазалар тобына жатады және сутегі асқын тотығының (H₂O₂) қатысуымен тотығу процесін катализдейді:

AH₂ + H₂O₂ —(пероксидаза)→ A + 2H₂O

Мұндағы AH₂ — сутегінің доноры, A — тотыққан донор.

Әртүрлі генотиптерде пероксидаза белсенділігінің өзгеруі патогенді қабылдау дәрежесіне тәуелді болуы мүмкін. Төзімді генотиптерді іріктеуде пероксидаза белсенділігі төзімсіздермен салыстырғанда жоғары болуы ықтимал.

Пероксидаза белсенділігін анықтау (А.Н. Бояркин әдісі)

Зерттеуде селективті агент ретінде Мурасиге және Скуг қоректік ортасына қосылған натрий хлоридінің әртүрлі концентрациялары қолданылды. Пероксидаза белсенділігі А.Н. Бояркин ұсынған әдіспен анықталды: әдіс бензидиннің тотығу реакциясының жылдамдығына және фотоэлектроколориметрде тіркелетін көк түсті тотығу өнімінің түзілуіне негізделеді.

Үлгіні дайындау

1 Каллус массасынан 200 мг өлшеніп алынды.
2 pH 4,7 ацетаттық буферімен кәрлен келіде біртекті массаға дейін езілді.
3 Қоспа буфер арқылы 50 мл колбаға ауыстырылып, 10 минут шейкерде араластырылды.
4 Ерітінді 1,5 мл эппендорф пробиркаларына құйылып, 3000 айн/мин жылдамдықта 15 минут центрифугаланды.
5 Тұнбаның үстіндегі мөлдір фракция фермент белсенділігін анықтауға қолданылды.

Өлшеу қадамдары

Құралды теңшеу

Қобдишалар құрал ұясына орнатылып, оптикалық реттеуіш арқылы жарық ағындары теңестірілді. Гальванометр тілшесі нөлге келтірілді, кейін есеп жүргізу үшін экстинкция мәні E = 0,125 немесе 0,250 етіп орнатылды.

Реакцияны бастау

Бақылау кюветасына 2 мл дистилденген су, тәжірибелік кюветаға 2 мл 3% сутегі асқын тотығы құйылып, секундомер бірден қосылды.

Нәтижені тіркеу

Пероксидаза әсерінен бензидин тотығып, көк түсті қосылыс түзіледі. Тәжірибелік кюветада ерітінді көгеріп, гальванометр тілшесі нөлдік белгіге жылжиды. Тілше нөлге жеткен мезетте секундомер тоқтатылып, уақыт белгіленді.

Ұсынылатын уақыт аралығы

Белсенділікті анықтағанда гальванометр тілшесінің нөлге 20–50 секунд аралығында жетуі өлшеудің дұрыстығына қолайлы деп есептелді.

Есептеу формуласы

Фермент белсенділігі (A) реакция жылдамдығына сәйкес шартты бірлікпен есептеліп, 1 г өсімдік материалына шақталды:

A = E · (a · b) / (n · c · t)

E: экстинкция (0,125 немесе 0,250)
a: ерітінді көлемі (50 мл)
b: кюветадағы реакциялық қоспаның сұйылту/кері пропорция коэффициенті
n: өсімдік материалының массасы
c: оптикалық қабат қалыңдығы (2 см)
t: уақыт (секунд)

Қорытынды

Зерттеу нәтижесі пероксидаза ферментінің белсенділігінің өзгеруі каллусты өсіруге арналған қоректік ортадағы натрий хлориді концентрациясына тәуелді екенін көрсетті. Бұл көрсеткіш селективті жағдайларда каллус линияларын бағалау және төзімді формаларды іріктеу үшін маңызды биохимиялық маркер ретінде қарастырылуы мүмкін.