Гибридомалық технологияның басты міндеті гибридомалардың, яғни гибридті жасушалар клондарын – иммунделген BALB c тышқандардың В-лимфоциттері мен миелома (ісік) жасушаларын будандастыру (гибридизацйя) арқылы алады. Бұл гибридті жасушалар бір жағынан телімді антиденелерді синтездеуге бейімделген болса, ал екінші жағынан бұлар жасанды қоректік орталарда шексіз өсе беретін қасиетті иеленген. Гибридомалық технология арқылы бір ғана жасушадан көбейген жасушалардың түзетін моноклоналды антиденелерін алуға мүмкіндік береді. Мұндай моноклоналды антиденелер жануарларды иммундеуге қолданған антигеннің тек бір ғана детерминатасына бағытталған және бұлардың телімділігі өте жоғары болып келеді.
Бертінге дейін гибридтеу мақсатымен тышқан мен егеу құйрықтың миеломалық клеткалары мен В – линфоциті қолданады. Олардан алынған антиденелерді кейбір кездерде емдеу мақсатымен қолдануға болмайды, себебі олардың өзі адам организімі үшін генетикалық бөгде зат болып саналады.
Қазіргі күні адамның гибридомаларын қолдану арқылы моноклональды антиденелер алынады. Бірақ ондай гибридомдарды алу қиынға соғады, оның себебі:
-адамның гибридомдары баяу өседі;
-тұрақсыздығы басым;
Адамдардың имундық клеткаларына негізделіп алынған гибридомалардың артықшылығы-тышқан мен егеу құйрықтың моноклоналды антиденелері анықтай алмаған, антигеннің сәлғана өзгерістерін анықтай алады. В – линфоцитінен тұратын химері гибридомдары алып байқалды, бірақ олар қазіргі күні сирек қолданылады.
Бүгінгі күні гибридомаларды алу, биотехнология саласының ең өзекті мәселесі болып отыр. Антиденелер немес иммуноглобулиндер жоғары арнайлы ақуыздар болады, бөтен антигендердің организімге енуіне жауап ретінде В – линфоцитімен өндіріледі және тек сол антиденелермен өзара байланыстыруға қабілетті. Антигендетар, есебінде инфекцияны қоздырушылар (бактериялар, вирустар, қарапайымдылар) инфекциялық сипаты емес биоорганикалық заттар. Моноклоналдық антиденелер технологиясында барты позицияға гибридома алу жатады. Олардың алу тарихы мынадай. Малекулярлық биолог Милистайн егеуқұйрық пен тышқанның миеломдық жасушаларын біріктіру жөнінде тәжірбиелер мен айналысты, оның ғылыми көмекшісі Келер иммуноглобулин синтезін кодтайтын гендер мутациялары үдерісін, иммундық жауапта антиденелердің вариабелдігін зерттеді. Келер миеломдық жасушаларды біріктіру техникасын меңгеріп, белгілі антигенге антидене секрециялаитын жасушалардың клонын алумен шұғылданады. Ол миеломдық жасушаны белгілі антигенмен бұрын қатынасы болған популяциядан алынған В – линфоциттер клонымен біріктіруді жобалады [4].
Моноклоналды антиделерді (МКА) жасайтын гибридомаларды алу технологиясы бойынша мынандай келесі жұмыстар орындалады.
Арнайы бір антигенге қарсы МКА алу үшін BALBc линиясының тышқандарының денесіне оны бірнеше рет егеді. Осының нәтижесінде тышқан организіміде антигеннің әрбір детерминанталарына қарсы бағытталған В-линфоциттері түзіледі. Иммундеу аяқталғаннан соң, тышқанның көк бауырынан оның линфоциттерін бөліп алып, оларды миеломамен араластырады. Сонан соң бұл жасушаларға бір –бірімен қосыла бермейді, тек кейбіреулері ғана гибридомаларды түзейді. Гибридомаларды осы қосылған жасушалардан бөліп алу үшін қоректік ортаға гипоксантин, амидопетрин және тимидиннен (ГАТ) құралған қарапайым затты енгізеді. Миелома гипоксантин – гунинфосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ) деп аталатын ферметтерді синтездеу қасиетінен айырылған, ал В-линфоциттері және басқа сау жасушалардағы ГГФРТ гифоксантинді басқа қосылысқа айналдырып отырады. Жасуша ішінде гипоксантин өзгеріске ұшырамаса, ол жасушаның улануына әкеледі. Сондықтан будандастыруға қатыспай қалған миелома өледі, бірақ гибридомалар мен В-линфоциттері жоғарыда айтылған ферменттің болғандығынан тіршілік әрекетін сақтайды. В-линфоциттері біріз уақыттан соң өзінен- өзі өледі. Өйткені, кәдімгі жасуша жасанды қоректік орталарда гибридома сияқты тоқтаусыз өсе алмайды. Міне, гибридомалар осылай миелома мен В-линфоциттерінен тазаланып шығады.
Әр гибридомадан 10-14 күн арасында клон – бір жасушаның ұрпақтарының жиынтығы пайда болады. Гибридомалардың арасынан антигенге үйлесімділігі жоғары антиденелер жасап жатқан клондарды иммунологиялық тәсілдердің (ИФТ, ИФР, АР және т.б.) көмегімен анықтайды. Клон тек біркелкі жасушалардан құралғандықтан және ол синтездейтін антиденеде біркелкі болғандықтан, осы гибридома қндіретін иммуноглобулиндерді моноклональді антиденелер деп атайды. Мұндай антиденелер, жоғарыда атап өткендей, тек бір ғана детерминантаға бұл бағытталған гибридома тоқтаусыз өсіп көбейіп отырғандықтан, ондай антиденені шексіз ала беруге болады [5].
МКА көп мөлшерін алу үшін гибридоманы сингенді тышқандардың бүйір қуысына енгізіп өсіреді. Бір тышқанның іш шеменінен 40-50 мг дейін МКА алуға болады.
Моноклоналды антиденелерді синтездейтін гибридомаларды алу әдісіне келесі методологиялық жұмыстар жол берген:
1) Миеломалар алу, оларды ағзадан бөлек өсіру;
2) Жасұшалардың соматикалық гибридизация әдісі.
Вирустарға қарсы тұратын иммуноглобулиндер поликлоналды гетерогенді антиденелер болады. Неге десек – олар әр түрлі клондардың В-лимфоциттерінің қоспасы.
Антигеннің молекуласының белсенді топтарының (бір неше аминқышқылдар) кешеңіне қарсы иммунды жасұшаларда (гибридомаларда) бір белгілі иммуноглобулин (моноспецификалы антидене) синтезделеді. Иммундық жасұшалардың ісік жасұшалармен гибридизациясы жасанды ісік – гибридома жаратады. Оны алу техникасы гибридомды технологияға жатады. Гибридомаларды жасұшалардың бір клонымен (моноклоналды антиденелер (МКА)) секреттелетін гомогенді антиденелер шығарады.
Моноклоналдық антиденелерді алу кезеңдері
1 жануарларды иммундеу;
2 иммунделген тышқандардың лимфоциттері мен миелома жасушаларын будандастыру;
3 МКА-ді синтездейтін гибридомаларды анықтау (скрининг);
4 МКА-ді тұрақты синтездейтін гибридомаларды клондау;
5 МКА-ге сипаттама беру;
6 гибридомалардыin vivo жән in vitroжағдайларында өсіру арқылы МКА-ді көп мөлшерде жинау;
7 моноклоналды антиденелерді тазарту;
8 гибридті жасушаларды сақтау (криоконсервация).
Әдістің ұстанымы. Гибридомаларды алу әдістің негізінде көкбауырдың сенсибилизденген лимфоциттердің және миеломды жасұшалардың қосылуынан кейін гибридтік жасұшалардың сериялық өсіруі жатыр. Кейіннен керекті ерекшелігі бар антиденелерді секреттейтін клондарды іріктейді. Іріктелген клонды жасұшалардың дақылдары ретінде сақтайды немесе тышқандардың ағзасында асцидтік ісік ретінде сақтайды. Гибридомды технология бір неше кезеңдерден тұрады: дайындық жұмыстар, моноклондарды алу, клондарды сақтау, реклондау, асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттілеу, антиденелерді тазалау.
Иммунизацияға алдын ала тазаланған антигенмен қолданады. Тышқандардың қарынына минерал майын немесе инертті қатты пластикті еңгізіп жануарлардың ағзасында ісік жаратылуға жол береді. Миелома жаратылуға жануардың генетикалық қасиеттері өте маңызды болады. Инбредтік тышқандардың тек қана екі түрінен осы ісіктерді алуға мүмкіншілік тұды. Антигенді 3-5 рет 0,5-5 мг мөлшерде еңгізеді. Бірінші инъекцияны Фрейнд адьювантымен жануарға 0,5 мл мөлшерде салады. Ақырғы иммунизациядан 2-4 күн өткеннен кейін тышқандарды өлтіріп, көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын дайындайды: көкбауырды зарарсыздандырылған жағдайда шығарып алып, оны хирургиялық пинцеттің көмегімен немесе сүзгіштен өткізіп бұзып суспензия жасайды. Суспензия көлемін 10 мл дейін Эрл ортасымен немесе тұзды буфермен жеткізеді.
Суспензияны 170 об мин 15 минут центрифугадан өткізеді. Микроскоп астында алынған суспензияның жасұшаларының өмірге кабілеттігін анықтайды. Анықтау жұмысын өткізгенде үлгілерді көк трипанның 0,1 пайыздық ерітіндісімен бояйды. Көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын гибридизациялық қосылуға дайындайды. Ол үшін алдын ала қосылудың алдында бір тәүлік бұрын 24-ұялық полистиролды платаның ұяларына 400 мкл қоректік жасұшаларды салады. Қоректік жасұшалар ретінде тышқандардың немесе теңіз шошқалардың макрофагтарын алады.
Қосылуды келесі түрде өткізеді: центрифугалық сынауықта 1 мл-де 75 пайызы өмірге жарамды қасиеті бар 108 көк бауырдың жасұшаларын және 107 миеломды жасұшаларды араластырады: 5 мл Дульбекко модификациялаған Игла ортасымен (МДСИ) жуады және 5 минут 100 об мин центифугадан өткізеді; тұнбаны 50 мл ыдысқа құяды. Кейіннен тұнбаға абайлап тамшымен 0,5 мл 50 пайызды ПЭГ 4000 ерітіндісін қосады, ыдысты 1 сағат аралығында сілкіп қойып суспензиялайды. Кейіннен қоспаға (суспензияға) тамшымен 10 мл МДСИ қосады; 10 минуттан кейін көлемді ГАТ ортасымен (құрамында гипоксантин, амидоптерин, тимин кешені) 50 мл-ге дейін жеткізеді.
Алынған суспензияны 1 мл-ден 24 ұялы платаға құйып 37 градуста 5 пайызды көмірқышқыл газы бар көмірқышқылды инкубаторда ұстайды; әр бір 4 күнде ортаны ауыстырып отырады.
2 – 4 жұма өткеннен кейін тірі қалған клондарды қоректік жасұшалары бар 96-ұялы платаға отыртады. Клондардың өмірге жарамдығын микроскоп астында анықтайды. Дақылды суйықтықты жұма сайын радиоиммундық, иммунофлуоресценттік және иммуноферменттік әдістер арқылы тексеріп тышқан иммуноглобулиндерінің барын анықтайды.
Тышқандардың ішіне бір неше рет көп уақыт минерал майларымен әсер етіп, олардың ағзаларында миелома тұдырып, жұмысқа жарамды миеломды жасұшаларды алады. Осы жасұшаларды әдейленген зертханаларда да алады.
Клондау жұмыстарын жалғастыру үшін ГАТ ортасына қоректік жасұшалар ретінде 500 мл ортаға 108 көкбауыр жасұшаларын және 106 перитонеалды жасұшаларды салады. Суспензияны 1 мл-ден 96-ұялы панельге құйып көмірқышқыл инкубаторда 37 градуста ұстайды. Әр бір үш тәүліктен кейін ортаны ауыстырып отырып, жасұшалардын өмірге жарамдығын тексереді. Дақылды суйықтықта секреттейтін клон болса моноклоналды антиденелер жаратылады. Іріктеліп алынған гибридоманың клонын келесі микродақылдарда реклондайды. Дақылды суйықтықтың құрамында моноклоналды антиденелер болса, оларды эксперименттерде, иммунодиагностикумдарды дайындау үшін биотехнологиялық үдірістерде қолданады.
Жұмыстарды ұйымдастыру және қолданылатын құрал-жабдықтар
Гибридомаларды алу жұмыстарын бөлек бөлмеде өткізеді. Келесі құрал-жабдықтар болу керек:
1.Ламинарлы бокс.
2.Бір белгілі мөлшерде ылғалды, температураны, көмірқышқыл газды ұстап тұратын инкубатор.
3.Центрифуга.
4.Микроскоптар.
5.+4 және -200 градус ұстайтын холодильник.
6.+37 және +560 градуста жұмыс істейтін су моншасы.
Осыдан басқа бөлек бөлмеде жасұшалар сақтау үшін -700 градусты тоңазытқыш және суйық азоты бар Дьюар ыдысы болу керек. Гибридомаларды алу үшін жасұшалардың дақылдарына арналған әдейленген пластикалы ыдыстарды дайындап қою керек. Олар: түбі тегіз 96-ұялы планшеталар, 24-ұялы планшеталар, көлемі 25, 75 см2 пластикалы ыдыстар, культивирлеуге арналған орталар, керекті реактивтер.
Экспериментке жануарды таңдау.
Иммунизацияға тышкандармен және егеу құйрықтылармен қолданады. Осы жануарлардың ағзаларында миеломды жасұшалар жақсы өседі. Басқа жануарлармен қолданбайды.